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繼發(fā)性登革熱IgG捕捉法檢測試劑盒

檢測程序

注： 確保所有試劑在開始測定前平衡至室溫（20-25℃）。在所給時間和溫度范圍以外進(jìn)行測試可能產(chǎn)生無效的結(jié)果。不在預(yù)定時間和溫度范圍內(nèi)的測試必須進(jìn)行重復(fù)。

ELISA程序

• 從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的微孔板并插入測試條槽。陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品和校準(zhǔn)品各需5個微孔，一式三份。確保剩下未使用的微孔密封于鋁箔袋內(nèi)。
• 使用適當(dāng)?shù)脑嚬芑蛭⒌味ò逑♂岅栃再|(zhì)控品（P）、陰性質(zhì)控品（N）、校準(zhǔn)品（CAL）和患者樣本。
  • 混合10μL血清與1000μL樣本稀釋劑?；旌暇鶆颉?/span> 

或者，

• 混合10μL血清與90μL樣本稀釋劑。取出20μL稀釋血清，加入180μL樣本稀釋劑?；旌暇鶆颉?/span>

• 吸取100 µL樣本稀釋劑、質(zhì)控品和校準(zhǔn)品添加至對應(yīng)的微孔中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL HRP標(biāo)記抗人IgG添加到每個微孔中。
• 蓋住測定板并在37°C ± 1°C孵育30分鐘。
• 用稀釋后的清洗緩沖液洗6次（參考清洗程序）。
• 吸取100 µL TMB添加到每個孔中。
• 在室溫（20-25℃）下孵育10分鐘，從第①次添加開始計時。藍(lán)色將會顯現(xiàn)。
• 按照相同順序吸取100μL終止液添加到每個孔中，計時同TMB添加步驟?；旌暇鶆?。藍(lán)色將變成黃色。
• 在30分鐘內(nèi)讀取每個孔在450nm波長的吸光度，參考濾波器為600-650nm。

注： 如果使用雙波長分光光度計，將參考濾波器設(shè)定在600-650nm之間。在沒有參考濾波器的情況下讀取450nm的微孔結(jié)果可能由于背景原因?qū)е挛舛绕摺?/span>

清洗程序

為了清除未復(fù)合的樣本或成分，有效清洗是ELISA程序的關(guān)鍵步驟。

A.自動洗板機(jī)

• *抽凈所有微孔。
• 在清洗循環(huán)期間將每個孔裝滿至邊緣（350μL）。
• 完成6次清洗后，將測定板倒立于吸水紙巾上用力敲打，確保清除所有清洗緩沖液。
• 為了確保有效清洗，必須維持自動洗板機(jī)良好的保養(yǎng)。必須始終遵守廠商的清潔說明。

B.手動清洗

• 將測定板的內(nèi)含物丟棄到適當(dāng)?shù)膹U物容器。
• 用適當(dāng)?shù)臄D壓瓶將微孔填滿清洗緩沖液。避免清洗緩沖液起泡，否則會降低清洗效率。立即丟棄微孔里的清洗緩沖液。
• 再將微孔填滿清洗緩沖液，并立即丟棄。
• 重復(fù)步驟（3）4次，共用清洗緩沖液清洗六（6）次。
• 后一次清洗完成后，丟棄微孔的內(nèi)含物并將測定板置于吸水紙巾上敲打，以確保清除所有清洗緩沖液。

質(zhì)量控制

每個試劑盒包含校準(zhǔn)品，陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。這些組成的可接受值參見附帶的規(guī)格表。陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品用于監(jiān)測重大的試劑失敗。陽性質(zhì)控品不能確保測定臨界值的精密度。如果質(zhì)控品或校準(zhǔn)品的任一吸光度讀數(shù)不符合規(guī)定，則測試無效且應(yīng)重新測試。如果測試無效，則不能報告患者結(jié)果。必須按照地方、州和/或聯(lián)邦法規(guī)或認(rèn)證要求以及實驗室標(biāo)準(zhǔn)QC程序執(zhí)行質(zhì)控（QC）要求。有關(guān)適當(dāng)?shù)腝C操作規(guī)程指南，建議用戶參考CLSI C24-A和42 CFR 493.1256。

預(yù)期值和測試局限性

• 必須結(jié)合患者的臨床體征和癥狀來做臨床診斷。該試劑盒的結(jié)果本身并沒有診斷作用，應(yīng)該與其他臨床數(shù)據(jù)和患者癥狀聯(lián)用。
• 陽性預(yù)測值取決于病毒存在的可能性。只能檢測有臨床癥狀或疑似接觸過相關(guān)病毒的患者。
• 黃病毒屬內(nèi)的血清型交叉反應(yīng)（登革熱1、2、3、4，日本腦炎，西尼羅河病毒，墨累山谷腦炎等）在IgG， 水平上十分常見^3,4,5。在東南亞進(jìn)行的試驗表明90%的日本腦炎患者（n=20）的IgG間接結(jié)果大于10 Panbio單位。
• 利用地方人群測定了臨界值。 人群血清流行病學(xué)在不同地理區(qū)域應(yīng)該隨時間而變化。終，臨界值需要根據(jù)對當(dāng)?shù)氐难芯窟M(jìn)行調(diào)整。
• 尚未確定目測結(jié)果判定的性能特征。
• ELISA篩選試驗結(jié)果表明登革熱感染的所有血清必須送到參考實驗室進(jìn)行陽性確認(rèn)和流行病學(xué)記錄。

性能特征

用Panbio Dengue IgG Indirect ELISA對386份經(jīng)過血凝抑制試驗（HAI）和ELISA方法的回顧性血清進(jìn)行檢測。這些血清包括來自以下組別的樣本：108份血清陰性樣本、84份原發(fā)性樣本、94份繼發(fā)性樣本和100份地方性樣本。 通過Panbio Dengue IgG Indirect ELISA 對這些血清樣本進(jìn)行檢測并將其結(jié)果與血清的登革熱感染狀態(tài)進(jìn)行對比，從而確定檢測的靈敏度、特異性和一致性。數(shù)據(jù)總結(jié)于表1。  

馬來西亞的一所大學(xué)通過基于世界衛(wèi)生組織（WHO）標(biāo)準(zhǔn)的HAI試驗將115份血清樣本確定為原發(fā)性或繼發(fā)性登革熱感染。 該試驗組由23份原發(fā)性和92份繼發(fā)性登革熱樣本構(gòu)成。

繼發(fā)性登革熱IgG捕捉法檢測試劑盒